Modifier l’ADN par CRISPR, une nouvelle page s’écrit

Par David Cune, Mailys Ayerdi, Alice Granados et Aurélien Perrier

Mots clés : Bionum, MEG
Etiquettes: CRISPR, épigénétique, génome, méthylation, Nasonia vitripennis

Les fameux ciseaux moléculaires CRISPR ont trouvé un nouvel emploi : l’épigénétique. C’est sur une guêpe, Nasonia vitripennis, que le Dr. Tom décide de tester sa nouvelle trouvaille : jouer sur la méthylation avec CRISPR, ce qui revient à jouer sur la façon de lire le génome !

PROLOGUE

Tout chercheur s’imagine ce moment de pur bonheur et de fierté lorsqu’une idée, travaillée depuis longtemps, se développe au point d’en devenir suffisamment élaborée et originale pour être présentée. Arrive ce sentiment de stress mêlé d’enthousiasme au moment de la proposer. On ne sait à quoi s’attendre: va-t-elle plaire? Sera-t-elle à la hauteur des attentes du laboratoire? Va-t-elle attirer d’autres chercheurs?

« Bon calme-toi, ce n’est qu’une idée. On en discutera lundi à tête reposée. Ça me semble possible, mais dur à réaliser … […] »

C’est en ces mots que le directeur du laboratoire d’épigénétique de l’Université de Leicester² reçoit l’astucieuse idée du Dr. Tom. Malgré l’hésitation de son supérieur, il est pleinement convaincu du potentiel de sa proposition. Cet entretien représente pour le Dr. Tom l’aboutissement, dans un domaine novateur, d’une réflexion lui tenant vraiment à cœur. Voici son histoire³:

CHAPITRE 1 – PREMIER CONTACT AVEC LA TECHNOLOGIE CRISPR

Tout commence il y a trois ans environ, au moment où le Dr. Tom, biologiste moléculaire, bondit du siège de son bureau fasciné par l’infinité de possibilités de recherche qu’il voit s’ouvrir à lui. Sur son écran d’ordinateur, s’affiche le titre d’un article scientifique : « The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9, Science 2014^A ». Il quitte alors son bureau, et après sa traditionnelle « cup of tea », rentre chez lui. Sa femme, voyant l’enthousiasme de son mari lui demande en souriant :

« Dis-moi Tom, tu as encore été au pub avec tes collègues français c’est ça ? Je t’ai déjà dit que les français sont plus robustes que les anglais…

– J’ai appris quelque chose de fantastique aujourd’hui, une révolution dans la biologie !

– Explique-moi alors, que je puisse également en profiter !

– Figure-toi que deux chercheurs ont mis au point le système CRISPR-Cas9 ! La Cas9 est une endonucléase qui a 2 lobes catalytiques qui sont reliés par un pont d’hélice alpha. Les deux domaines RuvC coupent le brin non chassé par l’ARN guide et le domaine HNH clive le brin chassé. Ces domaines sont codés par…

– Attends, attends, je ne comprends vraiment rien à ton histoire ! Est-ce que tu peux m’expliquer plus clairement la technique en reprenant les bases…, et pas tes bases azotées…

– D’accord je vais t’expliquer. La technique CRISPR-Cas9⁴ vient d’un système de défense bactérien à la base⁵. On pourrait la comparer à une paire de ciseaux moléculaires qui peut couper spécifiquement une région d’ADN. Le système CRISPR-Cas9 est composé de deux éléments : une endonucléase, appelée Cas9, qui agirait comme des ciseaux, et un ARN qui représenterait les pointillés de découpe.

L’endonucléase Cas9 peut couper les deux brins d’ADN mais si on veut cibler une région en particulier, tu comprendras qu’il faut qu’elle soit guidée au bon endroit. C’est l’ARN guide qui joue ce rôle en se fixant à l’ADN, en associant ses bases avec celles de l’ADN cible. Regarde, j’ai distribué cette image à mes étudiants pour leur expliquer :

L’ARN guide est composé de 2 parties différentes. La partie qui se fixe à l’ADN peut être modifiée en laboratoire très facilement, c’est pour ça que je t’ai dit qu’on pouvait choisir la région à couper. La deuxième partie a une forme particulière, complémentaire à celle de l’endonucléase Cas9 : c’est comme si les deux molécules s’emboîtaient.

C’est donc en s’associant à l’ADN par complémentarité de bases que l’ARN guide l’endonucléase à l’endroit souhaité, et qu’ensuite l’endonucléase coupe. Après cette coupure, un système de réparation d’ADN, naturellement présent dans la cellule, intervient. Celui-ci fonctionne selon 2 mécanismes distincts. Le premier, appelé jonction d’extrémités non homologues (NHEJ pour “Non Homologous End-joining”), répare directement la coupure en joignant les extrémités coupées, comme son nom l’indique. Celui-ci commet des erreurs, mais c’est ça qui nous intéresse : en effet, il insère ou enlève une partie des bases entraînant l’apparition d’une mutation. Ces mutations ont pour but de diminuer l’activité ou d’inactiver des gènes précis. Le deuxième, la réparation dirigée par l’homologie (HDR pour “Homology Directed Repair”), permet d’insérer une séquence d’ADN que l’on peut choisir et qui, à ses extrémités, a de fortes similarités avec l’ADN. Ces similarités s’appellent, “homologie” d’où le nom du système. Est-ce que tu as compris le principe ?

– Oui, ça va mieux, je vois ce qui se passe maintenant. Il s’agit donc d’un nouveau système de coupure efficace de l’ADN. Mais je ne comprends pas en quoi c’est une révolution ! Ça permet juste de couper l’ADN, ce n’est pas mieux que les… Comment ça s’appelle déjà… ce dont ton collègue m’a parlé lors du repas pour le départ en retraite de votre ancien directeur… Ah oui, les enzymes de restriction!

– Et bien, les enzymes de restriction permettent en effet de couper l’ADN comme l’endonucléase Cas9 de CRISPR. Mais, contrairement à Cas9, elles ne peuvent cibler que certaines régions de l’ADN, appelées “sites de restriction”, et… il n’y en a malheureusement pas partout! Ces sites sont un peu particuliers, on dit qu’ils sont “palindromiques” c’est à dire que l’on peut les lire dans les deux sens comme “Kayak”, l’enzyme de restriction peut alors les reconnaître sur les 2 brins d’ADN. Mais ces régions restent moins nombreuses que celles que CRISPR-Cas9 peut cibler. La Cas9 est guidée par l’ARN spécifique d’une région donnée du génome, et aujourd’hui, certaines compagnies privées construisent des molécules d’ARN base par base, selon les commandes. Ça augmente considérablement le nombre de régions que l’on peut cibler sur l’ADN, selon le souhait du chercheur. Il peut arriver cependant que la paire de ciseaux ne coupe pas sur les bons pointillés, entraînant des mutations non désirées sur des sites appelés ‘off-targets’. Mais néanmoins ces événements restent rares et heureusement, parce que ces mutations pourraient dérégler le fonctionnement de la cellule ! On en est qu’au début mais je pense que cette technique va devenir moins cher, plus rapide à construire et encore plus précise !

– Ah d’accord! Je comprends mieux ton enthousiasme. En attendant, les carottes ne vont pas se couper toutes seules, demande l’aide de CRISPR-Cas9 si tu en as besoin, ricane son épouse en sortant du salon. »

Ce premier contact avec la prometteuse technique CRISPR-Cas9 a marqué l’esprit du Dr. Tom, qui reste attentif aux avancées de celle-ci au fil des années.

CHAPITRE 2 – L’INGÉNIEUSE IDÉE DU DR. TOM. : L’UTILISATION DE CRISPR POUR UNE MÉTHYLATION CIBLÉE DE L’ADN

Trois ans plus tard, une autre révolution dans la technique CRISPR intéresse particulièrement le Dr. Tom. C’est entre deux écoutes de Despacito⁶ (la version biologique, bien entendu) que germe une ingénieuse idée pour un projet de recherche.

Avant de passer à son laboratoire, et d’en parler à son directeur, le Dr. Tom a pour mission d’instruire de jeunes étudiants de première année à l’Université de Leicester. Son fidèle Campbell sous le bras, il descend dans l’amphithéâtre et commence son cours d’un ton enthousiaste :

« Depuis Mendel, le Géant Vert de la génétique, les règles de l’hérédité ont été établies. Nous pensions avoir compris les mécanismes de la transmission des caractères, mais ceci était sans compter sur la traditionnelle exception. Prenons l’exemple des vrais jumeaux : leur génome est identique, c’est à dire que l’ensemble de l’information génétique contenue dans le noyau est la même pour chacun. Cependant, ils sont bien différents à l’âge adulte. Ce contraste s’explique par l’expression différente des gènes en fonction de divers paramètres, environnementaux notamment. L’ensemble de ces processus est regroupé sous le terme d’épigénétique, signifiant « au-delà de la génétique ». Comme dirait Thomas Jenuwein, “on peut sans doute comparer la distinction entre la génétique et l’épigénétique à la différence entre l’écriture d’un livre et sa lecture”⁷. L’un des mécanismes régulant l’activation des gènes, autrement dit leur expression, est la méthylation de l’ADN. Derrière ce gros mot, il y a une molécule s’appelant méthyle, qui lorsqu’elle se fixe sur l’ADN, modifie l’accessibilité de l’ADN à la machinerie de transcription, impactant ainsi l’expression de gènes . Ceci rend possible ou non l’expression de certains gènes, expliquant certaines différences observables chez les jumeaux… Major Tom to Ground control⁸, vous me suivez encore? Ne vous inquiétez pas, je vais vous distribuer un polycopié. »

Une fois le cours terminé, et après avoir répondu aux questions de ses étudiants, il range ses affaires avant de se mettre en route vers son laboratoire, plus impatient que jamais!

Il est exactement 10h42, lorsque le Dr. Tom entre en courant dans le bâtiment du laboratoire, transpirant et le regard pétillant. Il zigzague entre les différents personnels laborantins dans les couloirs, passe furtivement devant la pièce où se trouvent ses futures collègues, les guêpes Nasonia vitripennis, puis reprend sa route jusqu’au bureau de son supérieur. Il prend une grande inspiration, toque à sa porte, et entre décidé, se retrouvant face au Dr. Jerry. D’une grande stature et portant une barbe imposante, il est connu pour ne montrer son enthousiasme qu’en de très rares occasions.

« J’ai une idée et j’aimerais te la soumettre afin de lever des fonds ! Je me suis appuyé sur l’étude menée in vitro dans le laboratoire du Dr. Rudolf Jaenisch, à l’Université de Pékin^B. Je voudrais combiner le système CRISPR-Cas9 et l’épigénétique mais sur un modèle vivant. Ça n’a jamais été réalisé auparavant! s’enthousiasme le Dr. Tom.

– Hum well, What do you mean⁹? (Référence musicale 2017, volume 2)

– Je me suis dit qu’en plus d’être capable de modifier l’ADN précisément grâce à notre système CRISPR-Cas9, on peut s’en servir en épigénétique pour modifier la méthylation de l’ADN. En couplant les ciseaux (Cas9) à une méthylase, on est capable d’ajouter un groupement méthyle à l’endroit souhaité. Je me suis donc dit qu’on pourrait tester ce mécanisme sur nos petites Nasonia puisque cela n’a pas encore été fait in vivo.

– Mais pourquoi les Nasonia ? C’est un tout nouveau modèle, on ne pourrait pas plutôt utiliser nos Drosophiles ?

– On pourrait, mais je pense que c’est encore plus intéressant de le faire sur Nasonia. Ça nous permettrait de mettre en place un outil très original, dans un organisme prometteur à ne pas négliger à mon avis. On sait déjà que le système CRISPR-Cas9 fonctionne très bien sur ces guêpes^C. En plus, elles ont le même type de méthylation que les êtres humains contrairement aux Drosophiles, ce qui en fait de bonnes candidates pour l’étude de la régulation de certains gènes.

– C’est vrai que d’un côté pratique, on a juste à commander en ligne les larves qu’elles utilisent pour pondre leurs œufs , et on les conserve au froid. Et puis tu n’auras qu’à leur fournir ces larves une fois toutes les deux semaines… ça me semble pas mal du tout, du coup comment vas-tu t’y prendre pour le projet ?

– J’aimerais utiliser des vecteurs d’ADN circulaire qui vont chacun contenir de quoi coder un des éléments nécessaires au système CRISPR que j’envisage. L’un d’entre eux pourra permettre de produire la Cas9-méthylase tandis que l’autre codera pour l’ARN guide qui va permettre de cibler l’endroit que l’on veut. Ensuite, on injecte chacun des vecteurs dans une guêpe, ce qui permet de former 2 lignées différentes. En croisant ces lignées, on obtient une descendance le système complet, fonctionnel et efficace ! Tiens regarde, je t’ai fait un schéma!

– Pourquoi veux-tu faire 2 lignées différentes ? Pourquoi ne pas insérer tout dans la même lignée en une fois ? demanda Dr. Jerry.

– Très bonne question ! Je me suis dit que comme ça, on verrait directement l’effet de l’injection de chaque vecteur dans la guêpe. Si par exemple elle ne se développe pas, ce sera un problème dû à l’injection des vecteurs. Alors que là, après le croisement, on pourra voir directement l’effet de CRISPR.

– Bien pensé. Mais justement, il se pourrait que les guêpes ne se développent pas si on change trop la façon de lire l’ADN. Que ferais-tu dans ce cas ?

– Ne t’inquiètes pas, j’ai pensé à tout! Je me suis dit qu’on pourrait utiliser un système déclencheur de l’expression de l’ARN guide. Il ne serait donc actif qu’à un certain moment du développement de la guêpe.

– Comment vas-tu faire ça tout seul ? Ça va te prendre un temps fou, questionne Dr. Jerry.

– Ce n’est pas un problème, il y a une jeune étudiante française prometteuse, de l’Université Paris Diderot, qui vient me filer un coup de main. Ensemble, nous réussirons ce pari !

– Cela me paraît faisable, mais qu’est-ce que tu espères trouver ? Quelles sont tes perspectives? questionne Dr. Jerry, en se levant de sa chaise.

– Et bien il y a énormément d’applications à cela ! Pour commencer, ce système avec la méthylase sera une première in vivo! Cela va nous aider a comprendre l’impact qu’ont certains changements de la méthylation sur les gènes. On pourra ensuite extrapoler nos résultats sur Nasonia, faire des études sur certaines pathologies humaines en étudiant l’effet d’un changement de méthylation d’ADN sur les guêpes. On pourra aussi passer à l’étude de ces modifications sur des organismes sociaux, comme les abeilles dont une grande partie du comportement est régulé par les phénomènes épigénétiques^D, ainsi que la régulation des gènes au cours du développement. Ceci n’est qu’un début mais de nombreuses voies vont s’ouvrir. La communauté scientifique pourrait utiliser cette stratégie et l’appliquer au sein d’un spectre bien plus large de modifications épigénétiques !

– Bon calme-toi, ce n’est qu’une idée. On en discutera lundi à tête reposée. Ça me semble possible, mais dur à réaliser… Nous en reparlerons lors de notre réunion avec toute l’équipe lundi matin. Tu as fait du bon boulot en tout cas, allons au pub fêter la fin de semaine ! s’exclame le Dr. Jerry. »

EPILOGUE

En rentrant chez lui, le Dr. Tom raconte son projet prometteur à sa femme, qui vient de visualiser une énième fois son film fétiche “Bienvenue à Gattaca¹⁰”. Tout cela l’amena à se questionner sur les problématiques liées à la modification de l’ADN.

« Dis moi chéri, ce que tu viens de me raconter me perturbe un peu. Ta technique CRISPR-Cas9, on est d’accord qu’elle permet la modification de l’ADN où on le souhaite? Personne au sein de la communauté scientifique n’a pensé aux problèmes éthiques qui se cachent derrière? Je comprends parfaitement que l’on souhaite modifier le génome humain. Si un enfant a un risque élevé de développer une maladie génétique, j’aurais envie de modifier son ADN pour le guérir, mais vous n’avez pas peur que cette technique puisse conduire à des dérives en voulant créer l’enfant parfait? Ou que des personnes malhonnêtes l’utilisent pour modifier génétiquement certains virus les rendant plus dangereux ?

-Tu as parfaitement raison, cette question est au cœur des préoccupations actuelles. Pour le moment cela a été réalisées seulement sur des embryons détruits après l’expérience^20,21. Par contre, sa facilité d’utilisation et son faible coût n’excluent pas son utilisation par des gens malfaisants.

-Ça m’angoisse un peu ce que tu dis là …

-Mais c’est pour ça que de plus en plus on évoque la nécessité d’un moratoire, d’une concertation au sein de la communauté, d’une pause dans cette course effrénée à l’utilisation de CRISPR, pour définir un cadre clair d’utilisation et imposer un contrôle. Je pense que c’est une nécessité aujourd’hui. Pour ma part, j’essaye de sensibiliser mes étudiants à ces questions éthiques!

-Il le faut! Mais au fait, c’est bien demain la présentation de ton projet à ton équipe ? Tu ne stresses pas trop ?

-Oui et non, j’espère vraiment que ce projet pourra aboutir même si cela s’annonce difficile…

-Je suis certaine que cela peut marcher ! l’encourage sa femme.”

…

Le système CRISPR-Cas9 n’a pas fini de faire parler de lui! Que l’on soit méfiant ou enthousiaste face à cette technique, elle ne cesse d’intervenir dans les débats sur la manipulation des génomes. La communauté scientifique se doit maintenant de définir un cadre à son utilisation et de prévenir tout abus. Concernant le Dr. Tom, l’avenir nous dira s’il réussira à mettre en place et réaliser son ambitieux projet, pour pouvoir continuer cette histoire et commencer l’écriture du troisième chapitre…

Aurélien Perrier, Maïlys Ayerdi, David Cune et Alice Granados.

Références :

Images :
I : United States Department of Agriculture : https://www.ars.usda.gov/is/pr/2009/nasonia090812.jpg
II : Marc Crawford, ASME.org. Mai 2017. https://www.asme.org/engineering-topics/articles/bioengineering/8-ways-crisprcas9-can-change-world
III : CRISPR Therapeutics. http://www.crisprtx.com/our-programs/crispr-cas9-gene-editing.php
IV : Auteur: Françoise Ibarrondo https://planet-vie.ens.fr/338/francoise-ibarrondohttp://evobio.blog.lemonde.fr/2016/03/03/crispr-cas9-et-leradication-des-maladies-genetiques/
V : Pixabay : https://pixabay.com/fr/adn-acide-d%C3%A9soxyribonucl%C3%A9ique-2789567/

Sites internet / précisions :
1 : Pour en savoir plus : https://en.wikipedia.org/wiki/Nasonia_vitripennis
2 : Social Epigenetics’ Lab – University of Leicester (U.K.) : https://www2.le.ac.uk/projects/selab
3 : Série tv New York Unité spéciale : https://www.youtube.com/watch?v=3h9Zo9vO6dQ
4 : “CRISPR-Cas9 (“Mr. Sandman” Parody)” de Acapella Science : https://www.youtube.com/watch?v=k99bMtg4zRk
5 : Strange Stuff and Funky Things: http://ssaft.com/Blog/dotclear/?post/2015/06/25/CRISPR-la-mutagenese-qui-croustille
6 : “Evo-Devo (Despacito Biology Parody) de Acapella Science. https://www.youtube.com/watch?v=ydqReeTV_vk
7 : Thomas Jenuwein (Research institute of molecular pathology, Vienne, Autriche) dans un entretien rapporté par Frédéric Mathieu en 2014 dans Les valeurs de la vie: lecture actualisée de l’oeuvre de G. Canguilhem, Le Normal et le pathologique, 1966. Jouy-le-Moutier: ILV éd., 2014. (ISBN: 978-2-35209-777-8), p. 58.
8 : “Space Oddity” de David Bowie, produit et dirigé en 1972 par Mick Rock. https://www.youtube.com/watch?v=iYYRH4apXDo
9 : “What Do You Mean” de Justin Bieber https://www.youtube.com/watch?v=DK_0jXPuIr0
10 : “Bienvenue à Gattaca”, réalisé en 1998 par Andrew Niccol, avec Uma Thurman, Jude Law et Ethan Hawke http://www.allocine.fr/film/fichefilm_gen_cfilm=17079.html

Articles scientifiques :

A : Doudna, J. A., and E. Charpentier. “The New Frontier of Genome Engineering with CRISPR-Cas9.” Science 346, no. 6213 (November 28, 2014): 1258096–125809 : https://doi.org/10.1126/science.1258096.
B : Liu, X. Shawn, Hao Wu, Xiong Ji, Yonatan Stelzer, Xuebing Wu, Szymon Czauderna, Jian Shu, Daniel Dadon, Richard A. Young, and Rudolf Jaenisch. “Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.” Cell 167, no. 1 (September 2016): 233–247.e17. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.056 .
C : Li, Ming, Lauren Yun Cook, Deema Douglah, Abigail Chong, Bradley J White, Patrick Ferree, and Omar S Akbari. “Generation of Heritable Germline Mutations in the Jewel Wasp Nasonia vitripennis Using CRISPR/Cas9”, December 23, 2016. https://doi.org/10.1101/096578
D : Shpigler HY, Saul MC, Murdoch EE, Cash-Ahmed AC, Seward CH, Sloofman L, Chandrasekaran S, Sinha S, Stubbs LJ, Robinson GE. “Behavioral, transcriptomic and epigenetic responses to social challenge in honey bees”, April 2017. https://doi: 10.1111/gbb.12379
E : Liang, Puping, Chenhui Ding, Hongwei Sun, Xiaowei Xie, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Ying Sun, et al. “Correction of β-Thalassemia Mutant by Base Editor in Human Embryos.” Protein & Cell 8, no. 11 (November 2017): 811–22. https://doi.org/10.1007/s13238-017-0475-6.
F : Ma, Hong, Nuria Marti-Gutierrez, Sang-Wook Park, Jun Wu, Yeonmi Lee, Keiichiro Suzuki, Amy Koski, et al. “Correction of a Pathogenic Gene Mutation in Human Embryos.” Nature 548, no. 7668 (August 2, 2017): 413–19. https://doi.org/10.1038/nature23305.